PC實(shí)驗(yàn)室R又叫基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室
PCR是一種DNA快速擴(kuò)增技術(shù)，具有高度敏感性、特異性、快速等特點(diǎn)。當(dāng)某種病原微生物中病毒極少時，傳統(tǒng)的檢測方法難以檢出，但通過采用熒光定量PCR方法，可將DNA片段擴(kuò)增到百萬倍以上，從而提高疾病診斷技術(shù)。
PCR是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction)的簡稱。是一種分子生物學(xué)技術(shù)，用于放大特定的DNA片段，可看作生物體外的特殊DNA復(fù)制。通過DNA基因追蹤系統(tǒng)，能迅速掌握患者體內(nèi)的病毒含量，其精確度高達(dá)納米級別，精確檢測乙肝病毒在患者體內(nèi)存在的數(shù)量、是否復(fù)制、是否傳染、傳染性有多強(qiáng)、是否必要服藥、肝功能有否異常改變能及時判斷病人最適合使用哪類抗病毒藥物、判斷藥物療效如何、給臨床治療提供了可靠的檢驗(yàn)依據(jù)
1. 必須擁有標(biāo)準(zhǔn)的的PCR熒光實(shí)驗(yàn)室;實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,由于該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點(diǎn)，目前已得到廣泛應(yīng)用。
2. 檢測設(shè)備必須符合標(biāo)準(zhǔn)PCR熒光實(shí)驗(yàn)室設(shè)置要求;熒光定量PCR儀+實(shí)時熒光定量試劑+通用電腦+自動分析軟件，構(gòu)成PCR-DNA/RNA實(shí)時熒光定量檢測系統(tǒng)。
3. 必須通過國家臨床檢驗(yàn)中心的驗(yàn)收和認(rèn)證
4. 檢測人員必須通過國家臨檢中心業(yè)務(wù)培訓(xùn)并取得合格證書;
PCR實(shí)驗(yàn)室內(nèi)工作人員必須參加由國家衛(wèi)生部或各省臨床檢驗(yàn)中心舉辦的臨床基因擴(kuò)增培訓(xùn)班，并持證上崗。PCR實(shí)驗(yàn)室通過驗(yàn)收，實(shí)驗(yàn)室至少必須應(yīng)有兩個以上持有"臨床基因檢測上崗證"。
PCR實(shí)驗(yàn)室必須建立嚴(yán)格的實(shí)驗(yàn)室管理制度、建立標(biāo)準(zhǔn)化操作程序(SOP)、建立系列質(zhì)量管理文件等，確保實(shí)驗(yàn)室日常運(yùn)行符合國家衛(wèi)生部的要求，確保檢測結(jié)果準(zhǔn)確、確保實(shí)驗(yàn)室衛(wèi)生安全，確保實(shí)驗(yàn)室長期穩(wěn)定運(yùn)行,必須在無菌無塵環(huán)境下進(jìn)行操作能夠?qū)颊卟∏檫M(jìn)行科學(xué)、準(zhǔn)確、實(shí)時的掌控，并結(jié)合抗HBV與T細(xì)胞免疫來打破免疫耐受，阻斷肝病病毒復(fù)制的療法、有效的分解肝炎病毒，解決了乙肝病毒易變異、耐藥，病毒復(fù)制模板難以治療，人體免疫耐受狀態(tài)不易打破等醫(yī)學(xué)難題，能迅速消除臨床癥狀，而且有效抑制乙肝病毒復(fù)制，明顯加快e抗原、抗體的血清轉(zhuǎn)換速度，殺滅血液及肝細(xì)胞內(nèi)的病毒，為防止再感染提供了長期保護(hù)，有效阻斷和逆轉(zhuǎn)肝纖維化、肝硬化進(jìn)程
一、建立樣品準(zhǔn)備區(qū)
這個區(qū)域?qū)ｉT用作樣品的準(zhǔn)備，在制備和操作用于核酸提取的試劑時應(yīng)該采取預(yù)防措施:
⑴PCR產(chǎn)物和帶有要擴(kuò)增序列的DNA克隆不能在這個房間操作。
⑵組織培養(yǎng)物、組織標(biāo)本和血清樣品都帶進(jìn)樣品準(zhǔn)備間處理，以根據(jù)應(yīng)用的需要提取DNA或RNA。
⑶用于樣品處理的工具不能被用作普通分子克隆的工具，也不能用作操作靶序列。
⑷DNA樣品應(yīng)該用有專門的防護(hù)或正壓活塞式移液管操作，以防止在吸取樣品時有氣溶膠遺留。
⑸大體積樣品應(yīng)該用單獨(dú)包裝的無菌一次性移液管吸取。
⑹管子打開前都要簡短離心以減少氣溶膠的產(chǎn)生，而且管子不能用力崩開，這樣會產(chǎn)生氣溶膠。
⑺任何時候都應(yīng)該穿實(shí)驗(yàn)服和帶手套，手套要經(jīng)常更換，尤其在抽提過程中每一步之間都要更換。實(shí)驗(yàn)服要專門用于樣品準(zhǔn)備間，經(jīng)常清洗。樣品準(zhǔn)備和RNA-PCR RNA-PCR的額外步驟需要額外的樣品操作，這樣增加了樣品之間污染的機(jī)會。
二、建立前PCR區(qū)
該去專門用于準(zhǔn)備各種反應(yīng)，這個區(qū)域必須保持干凈，而且沒有來自克隆和樣品準(zhǔn)備的污染。前PCR區(qū)必須要有試劑和準(zhǔn)備，特別是專門用于前PCR區(qū)的正壓活塞式移液管。
三、PCR實(shí)驗(yàn)室試劑的操作
⑴所用的所有溶液都應(yīng)該沒有核酸和(或)核酸酶(DNase和RNase)污染。
⑵所有PCR試劑中使用的水都應(yīng)該是高質(zhì)量的-新鮮蒸餾的去離子水，用0.22μm過濾的，并且是高壓滅菌。
⑶在20℃到25℃貯存的試劑建議加點(diǎn)像疊氮鈉一類的抗微生物劑，在擴(kuò)增試劑或樣品制備試劑中加入0.025%的疊氮鈉不抑制擴(kuò)增反應(yīng)。
⑷所用試劑都應(yīng)該以大體積配制，實(shí)驗(yàn)一下看試劑是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量進(jìn)行貯存。
⑸所有試劑和樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的瓶子和管子。
⑹新配制的試劑在用于準(zhǔn)備新的標(biāo)本之前應(yīng)該加以檢驗(yàn)。
⑺樣品準(zhǔn)備和前PCR區(qū)所使用的移液管在不使用時都應(yīng)該小心保存。
四、在前PCR區(qū)建立PCR混合物
⑴可以把即刻可用的"主混合物"溶液配好、分裝并保存在-20℃或4℃，在實(shí)驗(yàn)室只涉及到擴(kuò)增一種或少數(shù)幾種特異序列時這樣做很有用
⑵如果你的實(shí)驗(yàn)室使用多套引物，以致于配制包括所有試劑的單一反應(yīng)混合物不夠經(jīng)濟(jì)，可以考慮分裝保存夠一天的PCR成分。
⑶作為一個規(guī)則，應(yīng)該保存一套陰性、弱陽性和強(qiáng)陽性對照樣品來分析樣品配制和PCR前過程的效率和潔凈程度。而且，你也希望通過使用一個已知的弱陽性樣品來驗(yàn)證你的樣品緩沖液以證明里面不含擴(kuò)增抑制物。
⑷陰性樣品要與每組樣品同時做，以分析是否存在樣品與樣品之間的污染以及是否存在PCR產(chǎn)物的污染，陰性對照應(yīng)該包括核酸以外的所有試劑。
⑸當(dāng)做陽性對照時，有兩個理由決定了應(yīng)該使用最少數(shù)量的核酸。
⑹由于必須有對照反應(yīng)，對照模板的特點(diǎn)應(yīng)該予以考慮。
五、控制污染的方法已設(shè)計(jì)出很有力的酶學(xué)方法用來消除一種形式的污染-使用UNG，這一技術(shù)能有效地消除由PCR產(chǎn)物引起的污染。另一種控制污染的方法是使用紫外線，這種方法不能完全消除污染問題，但可以將污染降低幾個數(shù)量級。
六、后PCR區(qū)PCR完成以后，需要分析樣品并解釋數(shù)據(jù)，應(yīng)該留出一個專門用于反應(yīng)后處理樣品的地方。后PCR活動中使用的所用試劑、一次性耗材和儀器都必須是專門用于這一目的，決不能把實(shí)驗(yàn)室這一區(qū)域的試劑或儀器用于任何前PCR活動。
